La expresión de proteínas insecticidas en caña de azúcar transgénica aumenta la resistencia a Diatraea Saccharalis

Abstract

          El barrenador de la caña de azúcar, Diatraea saccharalis, es una de las principales plagas del cultivo de caña de azúcar (Saccharum spp.) en el continente americano. Este insecto es controlado parcialmente mediante prácticas culturales, métodos biológicos y aplicaciones químicas; sin embargo, continúa ocasionando importantes pérdidas económicas. La transformación genética de la caña de azúcar con genes derivados de Bacillus thuringiensis (Bt) constituye una tecnología eficiente para el manejo de esta plaga. En caña de azúcar se ha reportado previamente la expresión de proteínas Bt individuales, aunque no la sobreexpresión apilada (stacking) de proteínas Cry y proteínas insecticidas vegetativas (Vip). En el presente estudio, genes cry y vip fueron incorporados mediante bombardeo de microproyectiles en callos embriogénicos de caña de azúcar de la variedad TUC 03-12. La presencia de los transgenes se evaluó mediante ensayos de PCR. Posteriormente, las líneas transgénicas fueron aclimatadas y multiplicadas en invernadero para su evaluación fenotípica y molecular. La presencia de las proteínas Cry y Vip se determinó mediante kits de detección por flujo lateral. La resistencia de las líneas transgénicas frente a D. saccharalis se evaluó mediante bioensayos bajo condiciones controladas, y los niveles de expresión de los transcriptos en las líneas candidatas se cuantificaron mediante ensayos de qRT-PCR. De las 374 líneas evaluadas por PCR, 229 resultaron positivas para al menos uno de los transgenes. La presencia de la proteína Cry se detectó en 123 líneas transgénicas evaluadas, mientras que la proteína Vip se detectó en tres líneas. Entre las 134 líneas evaluadas mediante bioensayos, 31 presentaron altos niveles de toxicidad frente a larvas de D. saccharalis (>90 % de mortalidad) y 29 líneas mostraron niveles de toxicidad que ocasionaron entre 67 y 89 % de mortalidad. De las líneas evaluadas fenotípicamente, se analizaron los niveles de expresión relativa de 19 líneas, observándose variaciones entre 3 y 140 veces para el gen cry y entre 2 y 1400 veces para el gen vip en comparación con plantas control no transformadas. La resistencia a insectos se incrementó significativamente mediante la transformación genética de la caña de azúcar con los genes cry y vip. El desarrollo de variedades transgénicas resistentes constituye una solución tecnológica que podría integrarse a programas de manejo integrado de plagas.

ABSTRACT

Transgenic sugarcane expressing insecticidal proteins increases resistance to Diatraea saccharalis

          The sugarcane borer Diatraea saccharalis is a major pest of sugarcane (Saccharum spp.) in the Americas. The insect is partially controlled by cultural, biological, and chemical methods, but still causes significant economic losses. Genetic transformation of sugarcane with genes from Bacillus thuringiensis (Bt) constitutes an efficient technology to address borer management. In sugarcane, the expression of individual Bt proteins has been previously reported, but not the stacking overexpression of Cry and vegetative insecticidal proteins (Vip). In the present study, cry and vip genes were incorporated by microprojectile bombardment into embryogenic sugarcane calli of the variety TUC 03-12. The presence of the transgenes was evaluated by PCR assays. Subsequently, transgenic lines were acclimated and multiplied in the greenhouse for phenotypic and molecular assessments. Lateral flow detection kits were used to determine the presence of Cry and Vip proteins. The resistance of transgenic sugarcane lines against D. saccharalis was evaluated through bioassays under controlled conditions. The expression levels of transcripts in candidate lines were quantified by qRT-PCR assays. Out of 374 lines evaluated by PCR, 229 were positive for at least one of the transgenes. The presence of the Cry protein was detected in 123 transgenic lines evaluated, whilst the Vip protein was detected in three lines. Among 134 lines evaluated in bioassays, 31 lines showed high toxicity levels to D. saccharalis larvae (>90% mortality) and 29 lines revealed toxicity levels causing 67-89% mortality. Of these phenotypically assayed lines, 19 relative gene expression levels were studied, showing variations between 3 to 140-fold for the cry gene and between 2 to 1400-fold for the vip gene compared with non-transformed control plants. Insect resistance was significantly improved by the genetic transformation of sugarcane with cry and vip genes. Developing resistant transgenic varieties will provide a technological solution that could be included into integrated pest management.