Implementation of a molecular diagnostic method of citrus black spot (Phyllosticta citricarpa) from a single lesion on fruit

Abstract

          It is essential to have a fast and accurate method of diagnosis of the Phyllosticta citricarpa fungus in citrus fruits because this pathogen is quarantined for severalinternational markets. For this purpose, an automated DNA extraction methodology was combined from an individual lesion of citrus black spot with the real-time PCR (qPCR) technique. Using this technique, it was possible to distinguish between P. citricarpa and the citrus endophytic fungus Guignardia mangiferae. The applied qPCR technique allowed the specific detection of P. citricarpa as no cross-reaction was observed with any other citrus pathogens or related Phyllosticta species. Reliable results were obtained since no false positives were detected. The qPCR with the TaqMan probe showed to be more sensitive compared to the different conventional PCRs analyzed. The real-time PCR proved to be viable, reproducible, specific, and highly sensitive for the detection of P. citricarpa under the conditions tested. This diagnostic tool has been proven to be reliable for analyzing citrus samples within certification programs for exporting fruits to markets where P. citricarpa is considered quarantine.

RESUMEN

Implementación de un método de diagnóstico molecular de la mancha negra de los cítricos (Phyllosticta citricarpa) a partir de una única lesión en frutos

          Es fundamental disponer de un método rápido y preciso de diagnóstico del hongo Phyllosticta citricarpa en frutos cítricos debido a que este patógeno es cuarentenario para varios mercados internacionales. Para esto, se combinó una metodología automatizada de extracción de ADN, a partir de una lesión individual de mancha negra de los cítricos, con la técnica de PCR en tiempo real (qPCR). Mediante esta técnica fue posible distinguir entre P. citricarpa y el hongo endófito de los cítricos Guignardia mangiferae. La técnica de PCR en tiempo real permitió la detección específica de P. citricarpa, y no se observó reacción cruzada con otros patógenos de cítricos ni especies relacionadas de Phyllosticta. Se obtuvieron resultados fiables, no se detectaron falsos positivos. La qPCR con sonda TaqMan demostró ser más sensible en comparación con las diferentes PCR convencionales analizadas. La qPCR demostró ser viable, reproducible, específica y altamente sensible para la detección de P. citricarpa, en las condiciones evaluadas. Esta herramienta de diagnóstico demostró ser confiable para analizar muestras de cítricos dentro de programas de certificación para la exportación de frutas a mercados donde P. citricarpa se considera cuarentenaria.